《黑龙江农业科学》 2009年02
17-19
出版日期：2009-03-10
ISSN:1002-2767
CN:23-1204/S
金正日球根海棠叶片组织培养诱导的研究
球根海棠(Begonia tuber hybrid Hens)以其花大、色艳而被誉为观花类秋海棠之王, 金正日是从球根海棠中选育出的红色大花品种。球根海棠是多年生球根花卉, 品种繁多, 硕大鲜艳的花朵形似茶花或牡丹, 美丽诱人, 观赏价值极高。球根海棠多年生草本, 地下具有肉质扁圆形的块茎, 为园艺杂交品种, 株高30 ～ 60cm。茎直立,肉质, 绿色或暗红色, 被毛。单叶互生, 叶片斜卵形, 先端锐尖, 叶缘有齿牙。花顶生, 重瓣, 紫红色、黄色或粉色等, 其花大如茶花, 直径可达20 cm, 花期9 月至翌年5 月。喜温暖湿润的生活环境, 夏季凉爽的气候, 在富含腐殖质, 排水良好的微酸沙质壤土上生长较好。球根海棠兼有月季、牡丹、茶花等名贵花种的色、香、姿、韵, 是珍贵的观赏花卉, 经济价值较高。球根海棠的传统繁殖方法是种子繁殖、扦插、嫁接、分株等方法, 繁殖系数低、苗木质量差、繁殖周期长、品种推广慢, 且受季节和自然发育的限制, 严重阻碍了花卉业在我国的迅速发展。近年来, 植物组织培养应用于植物的离体快速繁殖, 是目前应用最多、最广泛和最有成效的一种技术。利用组织培养便可以提高苗木质量,使品种纯化、优化, 加快繁殖速度, 提高经济效益。组织培养是国内外最先进的无性繁殖方法, 可以在短期内进行大量繁殖, 迅速形成生产规模, 以满足不断增长的广大鲜花消费者及市场的需求。1 材料与方法1 .1 实验材料供试材料为球根海棠金正日的幼嫩叶片。1 .2 实验方法1 .2 .1 外植体的获得与灭菌 金正日的组织培养以嫩叶作为外植体。在取材前15 d 左右, 把母株置于温室内,要防止往叶片上喷水。在接种前选择健壮无病的叶片剪下, 放入广口瓶, 加少量洗衣粉, 然后用自来水冲洗20 ～ 60 min。在无菌室内用73 %的乙醇灭菌3～ 5 s , 用无菌水冲洗一次,接着用0.1 %的氯化汞溶液浸泡5 ～ 7 min(浸泡过程要轻轻摇几次), 再用无菌水冲洗4 ～ 6 次, 将灭过菌的叶片放在无菌纸上, 剪成1cm2 左右的小块[ 1] 。接种到预制的已灭过菌的MS 培养基上,每个试管只接种一个外植体。1 .2 .2 培养基及培养条件 基本培养基为MS , 蔗糖生物技术黑 龙 江 农 业 科 学2 期 18 黑龙江农业科学3% , 琼脂0 .75 % , pH 5 .8。并添加有不同种类和浓度的植物生长调节剂。培养温度为(25 ±1)℃, 光照强度1 500 ～ 2 000 lx , 每日光照12 h[ 2] 。1.3 球根海棠愈伤组织诱导和分化的研究1.3 .1 激素组合对愈伤组织形成的影响 将配制好的8 种初始培养基分装在三角瓶中, 再将经过灭菌后接种在基本培养基中培养10 d , 无污染的叶片随机分成8 组, 每组30 块, 分别转接于8 种含有不同激素组合的初始培养基中进行初代培养, 培养室的温度控制在20 ～ 22 ℃, 光照强度在1 500 lx , 每天光照12 h[ 3] 。每天观察球根海棠叶片的变化, 观察、记录不同培养基中愈伤组织的发生时间、生长速度、发生数量及产生的愈伤组织的颜色等, 20 d 后分别统计在不同培养基中愈伤组织发生的块数。1.3 .2 不同培养基的不定芽分化比较 将配制好的8种初始培养基分装在三角瓶中, 再将在基本培养基中培养10 d 后无污染的叶片随机分组, 每组30 块, 分别转接于8 种含有不同激素组合的初始培养基中进行初代培养, 培养室的温度控制在20 ～ 22 ℃, 光照强度在1 500 lx , 每天光照12 h , 30 d 后转接一次[ 4] , 直到8 种培养基中都有不定芽的分化, 观察、记录不同基因型在不同激素组合下愈伤组织的增殖速度和数量及再分化开始时间、分化的速度、芽点的颜色、密集程度等, 统计在不同培养基中再生植株的多少。观察愈伤组织与不定芽发生的关系。2 结果与分析2 .1 激素组合对愈伤组织形成的影响取经无菌处理的外植体在无菌条件下, 分别接种在准备好的Al ～ A8 培养基上, 培养基pH 5 .8 , 琼脂8g · L-1 , 蔗糖30 g · L-1 。培养条件:培养温度(20 ±2)℃, 光强1 200 lx ,每天10 ～ 12 h 光照,4 周后观察愈伤组织形成情况(见表1)。表1 激素组合对愈伤组织平均诱导率的影响[ 5]序号培养基6-BA/ mg·L-1NAA/ mg·L -12 .4-D/ mg·L-1愈伤组织诱导率/ % 愈伤组织形成A1 MS 2 1 100 愈伤组织生长旺盛, 薄片疏松。A2 MS 2 0 .5 100 愈伤组织生长旺盛, 薄片疏松。A3 MS 2 0 .1 100 愈伤组织生长紧密, 颜色浅绿, 突起, 粗厚。A4 MS 2 0.5 100 形成淡绿色的愈伤组织,突起。A5 MS 1 0.5 100 形成淡绿色的愈伤组织,紧实、形成植株A6 MS 1 0 .5 100 形成淡绿色的愈伤组织,形成植株。A7 MS 1 0 .1 85 形成愈伤组织。A8 MS 0 .5 0 .1 80 形成愈伤组织。 经实验分析:在Ms 培养基上由于激素种类及含量的不同, 愈伤组织形成有差异。总趋势附加6-BA 、NAA 或2, 4-D 的各组分均形成愈伤组织, 诱导率100 %～ 80 %;随着NAA 的减少, 愈伤组织的体积生长变慢, 2 ,4-D 0.5 mg·L-1 对愈伤组织的形成作用比较大, 6-BA0.5 mg·L-1的浓度对愈伤组织形成作用比较大。在A1 、A2 培养基由于激素NAA 含量过高, 愈伤组织形成迅速, 但呈薄片, 疏松。A3 培养由于激素NAA 含量减少, 愈伤组织生长紧密, 颜色浅绿, 突起,粗厚。A4 没有激素NAA , 而添加激素2 ,4-D 0.5 mg·L-1形成淡绿色的愈伤组织, 有突起[ 6] 。A5 培养基6-BA 含量减少为1.0 m·L-1 , 也没有激素NAA , 取而代之的是2 , 4-D 0.5 mg·L-1 ,形成淡绿色的愈伤组织, 紧实、健壮。从试验情况可以总结出:A3 、A4 、A5 、A6 培养基都有利于愈伤组织形成, 且能达到粗厚健壮。也就是适宜激素含量范围为6-BA 2 ～ 1 mg · L-1 和NNA0 .5 ～ 0.1 mg·L-1 。表2 激素含量对不定芽分化率的影响[ 7]序号培养基6-BA/ mg·L-1NAA/ mg·L-12 .4-D/ mg·L-1不定芽分化率/ % 生长情况A1 MS 2 1 0 愈伤组织生长旺盛、疏松,继续培养不发芽, 后期死亡。A2 MS 2 0 .5 0 愈伤组织生长旺盛、疏松,淡绿色, 长时间无变化。A3 MS 2 0 .1 75 愈伤组织生长紧密、突起、粗厚, 继续培养9 周后出现细密的芽原基。A4 MS 2 0 .5 81 形成淡绿色的愈伤组织, 继续培养8～ 9 周后形成芽, 芽细小、密集。A5 MS 1 0 .5 95形成淡绿色的愈伤组织, 继续培养6 ～ 8 周后形成芽, 粗壮, 数量5 ～17 个不等。A6 MS 1 0 .5 95 4 周后形成丛生芽,每个瓶内8～ 17 个不等,粗壮。A7 MS 1 0 .1 95 4 周后形成丛生芽,芽细弱。A8 MS 0.5 0 .1 70 变化不大,继续培养16 周开始形成芽。2 期张凤生等:金正日球根海棠叶片组织培养诱导的研究生物技术黑龙江农业科学 192.2 激素含量对不定芽分化影响40 d 后观察含有不同浓度的外源激素6-BA 的培养基对愈伤组织形成和芽分化(见表2), 从试验情况可以看出激素种类、含量对不定芽分化有重要影响[ 8] 。Al 组织死亡是由于6-BA 、NAA 用量过高,A2 形成愈伤组织后不进行分化生长是由于6-BA 用量高造成的,A3 由于6-BA 浓度高形成愈伤组织后再分化形成芽,生长时间长。A4 由于2 , 4-D 的加入形成愈伤组织再发芽因而生长缓慢, 6-BA 高浓度使芽分裂多而细,A7生长素不足而影响生长[ 9] 。从苗的质量上看A5 和A6都可以作为建立无性系的培养基, 但从培养的时间上看A6 是最适宜的,A4 和A7 形成的芽细弱, 从研究结果可以看出1 mg·L-1的6-BA 即能满足愈伤组织不定芽的分化。从实验可以看出诱导再分化的最佳激素组合是:A6 培养基MS +6-BA1 .0 +NAA0.5 。3 结论与讨论在不同激素组合对愈伤组织形成的实验中, 我们配制了的8 种不同激素组合和不同浓度激素的培养基, 其中A3 培养基MS +6-BA2 .0 +NAA0 .1,A4 培养基MS +6-BA2 .0 +2 ,4-D0 .5 ,A5 培养基MS +6-BA1 .0+2 , 4-D0.5 、A6 培养基MS +6-BA1.0 +NAA0 .5 有利于愈伤组织形成, 配比组合均有利于球根海棠的脱分化即由外植体形成愈伤组织[ 10] 。经实验筛选出最适合诱导愈伤组织的培养基是MS +6-BA1 .0 ～ 2 .0 +NAA0 .1 ～ 0.5 。在愈伤组织的保持与不定芽的分化的比较实验中,A6 培养基MS +6-BA1.0 +NAA0 .5 有利于愈伤组织的形成和增殖, 有利于球根海棠愈伤组织的再分化。