《黑龙江农业科学》 2009年02
14-16
出版日期：2009-03-10
ISSN:1002-2767
CN:23-1204/S
27 种大麻资源的RAPD 聚类分析
大麻(Cannabissativa L .), 属大麻科(Cannabaceae),俗名汉麻、寒麻、线麻、花麻等, 其品种有150 个左右, 主要分布在亚洲和欧洲, 大麻具有其它作物所不可替代的优良特性,特别在纺织业和建筑业上, 具有其它作物所不可替代的优势, 现已成为许多国家重要的经济作物。由于大麻分布广,变异幅度大, 是一个形态多样化的类群, 并且大麻的引种交流逐年增多, 造成大麻的名称混乱, 即使同种大麻在不同区域的长期繁衍也会朝不同方向进化, 同种异名或同名异种的现象时有发生,我国经过几千年的人工栽培, 形成了许多地方品种, 给大麻的种质划分, 扩大栽培等方面带来不便。多年来国内对大麻的研究工作主要集中在引种、栽培、区划及少量品种选育等方面, 对大麻遗传多样性及育种的基础研究比较少。RAPD 标记技术是从分子水平研究大麻分化较合适的方法[ 1] , 由于该技术操作简单快速,成本低廉,且可以在没有任何分子生物学研究基础的前提下, 对大麻进行多态性分析。本研究选用在国内具有代表性的大麻栽培品种,利用RAPD 分子标记构建其基因组指纹图谱, 为大麻种质资源研究和遗传育种提供更多的依据。1 材料和方法1 .1 材料18 个省区的27 份大麻材料,均来自黑龙江省农业科学院经济作物研究所大麻资源库(见表1)。随机引物为Operon 公司的OP 系列[ 2-3] , 共15 组:OPA 、OPE 、OPG 、OPH 、OPO 、OPP 、OPQ 、OPR、OPT 、OPU 、OPV 、OPW、OPX、OPY 、OPZ , 总计300 条。1 .2 方法1 .2 .1 DNA 的提取本试验采用改进的CTAB 法提取大麻的DNA :取现蕾前期的等量雌雄株叶片, 研磨至粉末后迅速放置于预热到65 ℃的2 ×CTAB 缓冲液(含PVP),酚、氯仿抽提, 最后用75 %乙醇(100 μL)清洗两次, 干燥后溶于TE 缓冲液(pH8 .0)。分光光度计测量所提取DNA 浓度和纯度, 达到标准后分装, 置于-20 ℃保存。2 期张利国:27 种大麻资源的RAPD聚类分析生物技术黑龙江农业科学 15表1 27 份大麻栽培品种编号资源名称主要分布省份编号资源名称主要分布省份1 五常黑龙江15 宝鸡陕西2 勃利黑龙江16 淮阴江苏3 永宁宁夏17 重庆四川4 中卫宁夏18 温江四川5 塑原山西19 湟中青海6 昌图辽宁20 西宁青海7 祥云云南21 长白山吉林8 沧源云南22 寒麻安徽9 武都甘肃23 叶集安徽10 平邑山东24 邢台河北11 郯城山东25 宣化河北12 信阳河南26 托克托内蒙13 桐乡浙江27 霍城新疆14 平湖浙江1.2 .2 PCR 反应体系的建立对dNTP 、TaqDNA 聚合酶和引物的浓度进行了比较试验, 热循环状态中, 影响试验的主要是预变性时间和退火温度, 延伸温度是由TaqDNA 聚合酶本身特性决定, 一般不需调整。模板DNA 的纯度对扩增的特异性影响很大, 模板DNA的用量宁可少量, 但要纯些[ 4] 。经试验确定本研究的RAPD 反应体系:引物浓度为1.0 μmol·L-1 ,dNTP 为120 μmol·L-1 , 模板DNA 为45 ng , TaqDNA 聚合酶为2 U , 镁离子浓度为2 μmol·L-1 。反应热循环程序为:预变性94 ℃, 4 min ;变性94℃, 50 s;退火36℃, 1 min ,72 ℃延伸3 min, 循环40次;72 ℃延伸5 min, 4 ℃保存。1 .2 .3 引物筛选随机选取两个样品作模板, 利用稳定的试验体系对所有的300 个引物进行扩增, 并重复一次, 以期获得稳定的试验结果, 有些引物虽然扩增条带清晰, 但位点数少于3 个, 这类引物不适用, 从中筛选出扩增条带数较多、清晰度高、重复性好的引物作为聚类分析用的引物, 共筛选出34 个引物(见表2)。表2 适宜大麻分析的RAPD 引物(5’ -3’ )引物序列引物序列引物序列OPA -01 CAGGCCCTTC OPR-08 CCCGTTGCCT OPV -17 ACCGGCTTGTOPA -02 TGCCGAGCTG OPR-12 ACAGGTGCGT OPW-09 GTGACCGAGTOPA -12 TCGGCGATAG OPS -17 TGGGGACCAC OPW-12 TGGGCAGAAGOPA -15 TTCCGAACCC OPS -20 TCTGGACGGA OPW-16 CAGCCTACCAOPE-03 CCAGATGCAC OPT -08 AACGGCGACA OPW-17 GTCCTGGGTTOPE-16 GGTGACTGTG OPT -13 AGGACTGCCA OPX -09 GGTCTGGTTGOPG-02 GGCACTGAGG OPU -05 T TGGCGGCCT OPX -13 ACGGGAGCAAOPG-04 AGCGTGTCTG OPU -12 TCACCAGCCA OPX -17 GACACGGACCOPG-14 GGATGAGACC OPU -15 ACGGGCCAGT OPY-11 AGACGATGGGOPH -18 GAATCGGCCA OPU -17 ACCTGGGGAG OPZ-12 TCAACGGGACOPO-10 TCAGAGCGCC OPV -07 GAAGCCAGCCOPO-15 TGGCGTCCTT OPV -12 ACCCCCCACT1.2 .4 数据的记录与分析经电泳获得的基因组DNA 指纹图谱, 在两次试验中均能稳定出现的条带,用于数据分析。参照Williams 等的方法[ 5] , 记录时按RAPD 扩增的条带有无分别赋值, 有带记为1 , 无带记为0 , 不分强弱, 根据Nei 和Li 方法[ 6] 计算遗传距离和遗传相似性。遗传距离是用基因频率的函数表示的种群间的遗传差异, 遗传距离越大,说明亲缘关系越小;反之,则亲缘关系越大。计算公式:遗传距离GD =1-GI , 遗传相似性GI =2NXY /(NX +NY),NX 、NY分别表示X ,Y 两个个体或两个物种各自拥有的RAPD 标记数。NXY表示X ,Y两个个体或两个物种共同拥有的RAPD 标记数。同时用MEGA2 .1 软件进行UPGMA(unweighted pair gropaverage)聚类分析。2 结果与分析2.1 大麻品种的RAPD 多态性及遗传变异不同引物间其扩增带数和单态性带数具有一定的差异(见图1), 34 个核苷酸引物共扩增出261 条带,其中单态带28 条, 多态带233 条,多态位点比率为89.27%,计算公式为:多态位点比率P =具有多态的位点数/检测到的位点数。各个引物检测到的RAPD 位点在5 ～ 17 个, 可见,由于大麻是异花授粉作物,其异质性程度较高。1～ 27 同表1 ,C 为空白对照,M 为Marker图1 引物OPA -02 对27 份大麻品种扩增的基因组DNA 指纹图谱 其中34 个核苷酸引物对安徽叶集大麻所扩增的多态位点数最多, 为124 个, 多态位点比率为53 .22 %;对山西塑原大麻所扩增的位点数最少, 为69 个, 多态位点比率为29 .61 %。多态位点明显低于总的多态位生物技术黑 龙 江 农 业 科 学2 期 16 黑龙江农业科学点比率89.27%。谱带统计的结果是:不同引物扩增出的带数不同;同一引物在不同供试材料间扩增出的带数也不相同。共有带越多, 带型越相似的种群亲缘关系越接近。大麻的多态位点比率较高, 这与大麻的生态环境、分布密不可分。27 种大麻资源几乎分布全国,所以具有丰富的遗传多样性。大多数引物对不同品种的扩增产物存在显著的个体多态性, 这些个体多态性片断是进化中变异活跃的片断, 它们反映了品种的分化和变异程度, 而那些品种间所共有的片段则为进化中保守的。多态位点比率是衡量一个种群内遗传变异水平高低的一个重要指标。一个种群多态位点比率高, 说明这个种群适应环境能力较强;反之, 这个种群适应环境能力较弱, 在长期的进化中被淘汰的可能性就越大。其中,叶集、西宁、霍城和寒麻多态位点比率高,说明这几个品种适应环境能力较强;而塑原多态位点比率很低, 只有29.61%,说明这个品种适应环境能力较弱。2 .2 大麻品种间的聚类分析经计算, 大麻各品种间的遗传距离为0 .0511 ～0.5912 , 平均为0 .3839 , 变化幅度较大。遗传距离最大的是西宁(20)和勃力(2), 遗传距离为0 .5912, 说明其亲缘关系最远, 霍城(27)与湟中(19)之间的遗传距离次之, 为0 .5624 。遗传距离最小的是勃利(2)和昌图(6),为0.0511 , 说明其亲缘关系最近, 托克托(26)与湟中(19)的遗传距离也较小,为0 .0793 。根据27 个品种间的遗传距离, 经UPGMA 聚类分析可得如图2 的树状图, 从中我们可以清楚的看出各个品种之间的亲缘关系, 当遗传距离为0.336 时, 可将27 种大麻分为3 类,A 类包括10 种大麻, 为11 、7 、8 、13、14、22 、23 、17、18 、24(见图2), B 类只有两种20 和27,C 类包括2 、6 、1、21、9 、10 、26、19 、25 、5、15 、16 、12、3 、4共15 种大麻。图2 27 个大麻品种基于RAPD 数据的UPGMA 聚类图 从表1 和图2 可以看出, 大麻的分类呈现出一定的地域特征, 同一省或者同一地区的大麻往往聚为一类, 如云南(7 、8)、浙江(13、14)、安徽(22 、23)、四川(17、18)的各两种大麻都聚为了A 类, 东北地区的四个品种(1 、2、6 、21)以及宁夏的两个品种(3 、4)同属于C 类, 同时发现A 类中大部分品种属于长江以南省份,C 类中大部分品种属于长江以北地区, 而C 类的品种比较少,只有托克托(26)和霍城(27), 同属于西北部地区, 这是大麻长期进化中适应当地环境的结果, 这也进一步证明了RAPD 技术用于分析大麻亲缘关系的可靠性。但是也有部分品种不是按地域分布聚类的,即使是属于同一省的品种, 比如邢台(24)和宣化(25)同属河北省,但邢台为A 类、宣化为C 类, 山东的郯城(11)和平邑(10)分属A 类和C 类。具有一定的地域混杂性,这有可能是种质资源交流的结果。总之, 大麻的分布总体上呈现出一定的地域性,又有一定的地域混杂性。3 结语就目前的报道来说,大麻的核型类型有1B 、2B 、2A三种类型, 均属于比较原始的类型, 基于RAPD 的大麻聚类分析, 是否能与其核型基本相对应, 哪些同一地区又不属于同一RAPD 分类的品种, 它们的进化趋势是否相同,这些都是我们很感兴趣的问题, 细胞学标记是非常稳定可靠的分类依据, 核型指标在种内相当恒定,即使数目相同, 在染色体组中不同类型染色体的数量和位置也不同, 在目前大麻研究基础比较薄弱的情况下,RAPD 技术与细胞学标记的综合应用将会有效克服单一方法存在的局限性, 获得快速稳定的分类结果。为今后大麻的遗传变异、杂交育种、品种引进以及分类, 提供研究基础。