《黑龙江农业科学》 2009年02
12-13,19
出版日期：2009-03-10
ISSN:1002-2767
CN:23-1204/S
不同激素组合对辛夷花瓣愈伤组织诱导的影响
辛夷(Li ly magnolia)为木兰科木兰属玉兰亚属植物[ 1] ,别名玉兰、望春花, 以其花蕾(学名辛夷花)供药用, 具有镇痛、镇静、消炎、降压及收缩鼻黏膜血管等功能, 为常用中药材[ 2] 。有关资料显示, 辛夷挥发油的质量分数高达5 .41 %, 是名贵的香料资源。它不但在医药、香料等方面用途广泛, 而且还是木材和庭园绿化的优良树种, 开发前景非常乐观[ 3] 。但由于辛夷植物两性花中雄蕊早落或雌雄花花期不同等原因, 使得其自然繁殖能力很差。在我国自然分布或引进的30 多个树种中, 除望春玉兰(biondiiM.)、玉兰(denudanta M.)、紫玉兰(lili f lora M .)等少量树种被较多应用外, 大多数树种因种源稀缺等原因而未被妥善经营和利用。同时, 由于对该类植物的开发和利用研究起步较晚, 加之某些种的分布地域狭窄,采种困难等诸多因素,致使该类植物繁殖研究滞后, 开展辛夷植物无性繁殖技术研究, 不但可有效增加这些树种的资源存量,为经营和利用打下物质基础, 而且对这些树种的物种保护和永续利用均有重要意义。因此, 加强辛夷树种的无性繁殖工作具有重要的生态意义和经济价值[ 4] 。当前,对辛夷植物进行的无性繁殖研究中, 主要包括扦插、嫁接和组织培养, 在生产实践中, 由于该类植物扦插生根困难, 人们常常采用高枝压条来进行无性繁殖,成株率高, 但繁殖系数小。因此, 对辛夷树种的组织培养工作正在受到众多科研工作者的重视, 建立优良的无性系, 对保存珍贵的辛夷种质资源具有重大意义。但就目前的具体情况来看, 有关辛夷的组织培养的报道并不多, 大部分处于初步探索的阶段。其中,广东周丽华等1999 年5 月从以黄兰为砧木的紫玉兰嫁接苗上采其当年生的嫩梢作外植体进行了组织培养工作,得出紫玉兰芽的增殖和继代的最适宜的培养基为MS +6-BA2 .0 mg· L-1 +IAA 0.1 mg ·L-1 +3 %蔗糖, 紫玉兰再生无根苗生根的适宜培养基为1/2MS +IBA 2 .0 mg·L-1 +NAA0 .2 mg·L-1 +1 .5 %蔗糖, 为辛夷组织培养提供了宝贵的经验[ 5] 。本实验通过以辛夷幼嫩花瓣为外植体, 利用不同激素及其不同浓度配比对其愈伤组织诱导进行研究, 为辛夷的组织培养提供有效的方法, 从而为辛夷的快速繁殖提供新的途径。2 期赵松峰:不同激素组合对辛夷花瓣愈伤组织诱导的影响生物技术黑龙江农业科学 131 材料与方法1.1 材料河南南召辛夷, 以未开放的花蕾为实验材料。1.2 方法1.2 .1 无菌材料的获得 2 月下旬采集辛夷花蕾, 放在冰箱中保存。实验时取辛夷的幼嫩花蕾, 在自来水下冲洗25 min ,去除其表面黏附物。在超净工作台上,用75%的酒精浸泡50 s , 并不断摇晃, 然后放入0.1 %的升汞溶液中浸泡6 min(通过预实验可得消毒时间为6 min 时外植体污染率最低。当缩短灭菌时间时, 外植体污染率较高;当增加灭菌时间时, 外植体死亡率升高), 再用无菌水冲洗4 次。将灭菌后的外植体放在灭过菌的滤纸上, 吸干其表面的水分, 再将辛夷花蕾近基部1/4 处切除, 剥去苞片, 取出幼嫩花瓣并横切成两块作为外植体备用。1.2 .2 外植体接种及培养将切好的花瓣接种于愈伤组织诱导培养基中, 正交设计如表1 :6-苄氨基嘌呤(6-BA)浓度(0.5、1 .0 、2.0 、3 .0 mg·L-1), 萘乙酸(NAA)浓度(0 .5、1 .0 、2 .0、3.0 mg·L-1), 每组合接种三皿, 接种密度都为每皿(直径为7 .5 cm 的培养皿)10 块花瓣,再用封口膜封口, 将其放在温度为(23 ±2)℃的培养室表1 正交设计组合6-BA/mg·L-1 NAA/ ㎎·L-1A1 0.5 0 .5A2 0.5 1 .0A3 0.5 2 .0A4 0.5 3 .0A5 1.0 0 .5A6 1.0 1 .0A7 1.0 2 .0A8 1.0 3 .0A9 2.0 0 .5A10 2.0 1 .0A11 2.0 2 .0A12 2.0 3 .0A13 3.0 0 .5A14 3.0 1 .0A15 3.0 2 .0A16 3.0 3 .0中进行暗培养。接种后每隔5 ～ 10 d 观察, 20 d 后统计诱导率。本实验设计3 次重复, 每次重复采用30 个外植体(3 个培养皿, 10 个外植体·皿-1)。2 结果与分析2 .1 不同激素组合对辛夷花瓣愈伤组织诱导的影响外植体接入附加不同激素组合的培养基上, 第5天花瓣开始长大, 随着培养的时间加长, 花瓣越长越大,有些花瓣的颜色变浅。培养14 d 后花瓣开始膨大、变厚,并逐渐产生愈伤组织, 但不同激素组合对辛夷幼嫩花瓣愈伤组织的诱导作用不同(见表2)。表2 不同浓度激素组合对愈伤组织诱导的影响组合外植体总数愈伤个数诱导率/ %A1 90 10 11 .1A2 90 9 10 .0A3 90 2 2 .2A4 90 2 2 .2A5 90 28 31 .1A6 90 24 26 .7A7 90 16 17 .8A8 90 15 16 .7A9 90 19 21 .1A10 90 18 20 .0A11 90 9 10 .0A12 90 8 8 .9A13 90 13 14 .4A14 90 4 4 .5A15 90 3 3 .3A16 90 0 3 .32 .2 不同激素组合对辛夷花瓣愈伤组织诱导影响的比较由表3 可以看出, 当6-BA 浓度相同时, 随着NAA浓度的增大, 辛夷幼嫩花瓣愈伤组织的诱导率逐渐减小;由表4 可以看出, 当NAA 浓度相同时, 随着6-BA浓度的增大, 辛夷幼嫩花瓣愈伤组织的诱导率先增大后减小。就整体而言, 不同激素组合对辛夷幼嫩花瓣愈伤组织诱导的影响不同, 高浓度的6-BA 和NAA 都不利于辛夷幼嫩花瓣愈伤组织的诱导, 当6-BA 和NAA 的浓度都为3.0 mg·L-1时, 没有愈伤组织产生,可见高浓度的外源激素对愈伤组织的诱导有抑制作用。结果表明:辛夷幼嫩花瓣愈伤组织诱导的最佳培养基为MS +6-BA1 .0 mg·L-1 +NAA0 .5 mg·L-1 ,诱导率为31 .1 %。表3 同一6-BA 浓度下愈伤组织诱导率随NAA 浓度变化的情况6-BA/ mg·L-1 NAA 浓度梯度/ mg·L-1 愈伤组织诱导率变化情况/ %0.5 0.5※1.0 ※2 .0 ※3.0 11.1 ※10.0※2 .2 ※2 .21.0 0.5※1.0 ※2 .0 ※3.0 31 .1 ※26 .7 ※17 .8 ※16 .72.0 0.5※1.0 ※2 .0 ※3.0 21 .1 ※20.0 ※10.0 ※8 .93.0 0.5※1.0 ※2 .0 ※3.0 14 .4 ※4 .5※3.3 ※0表4 同一NAA 浓度下愈伤组织诱导率随6-BA 浓度变化的情况NAA/ mg·L-1 6-BA 浓度梯度/ mg·L -1 愈伤组织诱导率变化情况/ %0.5 0.5※1.0 ※2 .0 ※3.0 11 .1 ※31 .1 ※21 .1 ※14 .41.0 0.5※1.0 ※2 .0 ※3.0 10 .0 ※26.7 ※20.0 ※4 .52.0 0.5※1.0 ※2 .0 ※3.0 2 .2 ※17 .8 ※10 .0 ※3 .33.0 0.5※1.0 ※2 .0 ※3.0 2.2※16 .7※8.9 ※03 讨论作为建立再生体系的前提和基础, 愈伤组织的诱导是非常关键的。愈伤组织的形成过程一般分为三个阶段:诱导期、分裂期和形成期。大量的研究表明, 几乎所有高等植物的各种器官(如根、茎、叶和花等)以及各种组织(如皮层、茎髓和形成层等)离体后在适合条件下都能产生愈伤组织。愈伤组织诱导的成败关键不是外植体的来源和种类, 而是培养条件, 其中植物生长调节剂的种类和浓度最为重要。诱导愈伤组织的培养基中植物生长调节剂的配比, 一般为生长素类和细胞分裂素类间的配比。用于诱导愈伤组织的植物生长调节剂有2 ,4-D 、6-BA 、KT 、ZT 、NAA 等[ 6] 。在植物愈伤组织的诱导中, 虽然对NAA 的利用不是很多, 但NAA 对愈伤组织的诱导也有很重要的作用。林娅等研究表明,NAA 诱导愈伤组织的效果优于2, 4-D ,NAA 与任何一种细胞分裂素类物质结合使用,愈伤组织诱导率都为100 %。龙雯虹等对萝卜愈伤组织的诱导研究也指出, 不同的生长素类物质对萝卜愈伤组织的诱导效果不同, 诱导效果为NAA >2 , 4-D >IBA , 但植物生长调节剂对不同植物的诱导效果不同,在诱导植物愈伤组织时,NAA 的使用浓度范围一般为0.05～ 20 mg·L-1[ 7] 。不同激素组合对辛夷幼嫩花瓣愈伤组织诱导的影响不同,司怀军等对菊花幼嫩花瓣愈伤组织的诱导研究表明,菊花幼嫩花瓣是诱导愈伤组织的良好材料, 在MS +6-BA2 .0 mg·L-1 +NAA1.0 mg· L-1 的培养基上诱导率可达100 %[ 8] 。本实验中, 辛夷幼嫩花瓣愈伤组织诱导的最佳培养基为MS +6-BA1 .0 mg · L-1 +NAA0.5 mg·L-1 , 诱导率为31 .1%。但总体来看,辛夷幼嫩花瓣愈伤组织的诱导率偏低, 因此提高其愈伤组织诱导率还有待于进一步探索。