《黑龙江农业科学》 2009年02
9-11
出版日期：2009-03-10
ISSN:1002-2767
CN:23-1204/S
不同日龄大白猪视黄素X 受体α基因的表达研究
视黄酸已被证明在脊椎动物的发育和调节体平衡方面有着重要作用。它的效应是通过专门的核受体蛋白介导的, 这些受体属于视黄酸/甲状腺激素受体超家族[ 1] 。除了已被命名的RARα, β , γ外, Mangelsdorf等[ 2] 又发现了另外一种核受体称为视黄素X 受体(retinoidX receptor ,RXR)。这个受体在配体结合区不同于其他三种RARs, 而且它自身不具备与视黄酸的高亲和力。RXRα既可以形成同型二聚体, 也可以形成RXRα/RARs 异源二聚体行使功能,而且这两种模式决定了视黄酸的两种不同反应途径。作为RARs 的一个异二聚体,RXRα不是一个结合配体, 而是一个辅助因子。RXRα如果与另外一种核受体LXRα形成一个有功能的异源二聚体, 则它是一个有活性的配体结合亚单位, 这种交互作用可能是视黄酸对靶基因起作用的另一个反应途径[ 3] 。本研究以大白猪为实验材料, 对RXRα基因的表达规律进行了研究, 以期对该基因在猪体内运载视黄酸过程中所起的作用及其他生理功能做进一步的探讨。1 材料与方法1 .1 实验动物选取2 ～ 3 胎龄的经产大白猪母猪8 头, 同期进行纯繁,其后代用于实验。分别在1、90 、180 、270 、360 日龄随机选取大白猪母猪各4 头进行断颈宰杀, 随后迅速取下心、肝、胃、脾、肾、肺、大肠、小肠、肌肉、子宫、卵巢共11 种组织, 置液氮中速冻, -70 ℃冷冻保存。大白猪由哈尔滨市三元种猪场提供。1 .2 RNA 的提取及转录严格按照Invitrogen 公司的TRIZOL 试剂说明书提取RNA ,在紫外分光光度计上测定RNA 的浓度和纯度。用TaKaRa 的BcaBESTTMRNA PCR Kit Ver1 .1试剂盒反转录成cDNA 。1 .3 引物设计及PCR 扩增内标基因选择β-actin 。各个组织的RXRα的PCR扩增均在单管中进行, 以β-actin 为内标, 每样品作2 次重复,同时用ddH2 O 分别取代RNA 样品和RT 产物作为对照,以检验是否有基因组和外源DNA 污染, 并生物技术黑 龙 江 农 业 科 学2 期 10 黑龙江农业科学用混合样品(待测样品等比例混合)来建立最佳反应条件和校正不同批次间的差异。β-actin 基因(GenBank 登陆号U07786)的引物序列:P1 :5’ -CGGGACCTGACCGACATCCA-3’ , P2 :5’ -GGGCCGTGATCTCCTTCTG-3’ ;RXRα基因(GenBank 登陆号AF103947)的引物序列:P3 :5’-CGAGCCCAAGACCGAGAC-3’, P4 :5’-TGCCCTCAGCAGGATGA-3’。PCR 扩增反应条件如下:β-actin 基因:94℃ 5 min ;24 个循环:95 ℃ 30 s , 58 ℃ 30 s, 72 ℃40 s;72℃ 10 min ;RXRα基因:94℃ 5 min ;34 个循环:94 ℃30 s , 55 ℃30 s, 72℃ 40 s;72℃ 10 min 。1.4 电泳及灰度分析取10 μL PCR 产物, 在1 %琼脂糖凝胶上电泳,EB染色,用BioRad 的QuantityOne 图像分析系统分析条带灰度。为减少批间误差, 所有样品均包括在同一次PCR 中, 每一样品重复2 次, 以平均值表示最终结果。2 结果与分析2 .1 PCR 扩增循环参数的确定PCR 扩增β-actin 基因时, 起始循环数从21 开始,模板为1 μL(50 ng), 每隔1 个循环将反应管拿出1 管,直至30 个循环。RXRα基因为26 到35 个循环。PCR反应后进行电泳, 分析IOD 值, 发现PCR 扩增产量呈规律的直线性增加(见图1)。2 .2 RT-PCR 扩增结果RXRα基因在1 日龄大白猪的10 个所检组织中均图1 PCR 循环数与产量的关系表达,且不同组织间的表达量差异不明显。在90 日龄大白猪的心脏、肝脏、子宫和卵巢中均不表达,其余组织均表达,但是在肌肉中的表达量非常低,在肾脏中的表达量最高。在180 日龄大白猪的心脏、胃和子宫中均不表达,其余组织均表达,但是在肺中的表达量非常低, 其次是卵巢, 其余组织的表达量差异不明显。在270 日龄大白猪的心脏、胃和脾脏中均不表达, 其余组织均表达, 但是在子宫和卵巢中的表达量非常微弱, 其余组织的表达量较高,且差异不明显。在360 日龄大白猪的肝脏、大肠和子宫中均不表达,其余组织均表达, 但是在心脏中的表达量非常微弱, 在小肠和肌肉中高表达, 其次是卵巢, 其余组织的表达量差异不明显(见图2)。A :1 日龄;B:90 日龄;C :180 日龄;D:270 日龄;E :360 日龄。A ～ E 中, 左侧为不同日龄大白猪的β-actin 和RXRα基因在不同组织的RT-PCR 产物琼脂糖电泳图。1 ～ 11 分别表示大白猪的心、肝、胃、脾、肾、肺、大肠、小肠、肌肉、子宫、卵巢,M :DL2000。右侧为大白猪的RXRα基因mRNA 表达量的模式图。图2 不同日龄大白猪RXRα基因表达情况3 讨论Almasan 等[ 4] 将RXRα基因定位在9q34 .3。Tontonoz等[ 5] 发现了一个脂肪组织内的特异转录因子ARF6, 它是RXRα和PPARγ的一个异二聚体。核受体PPARγ/RXRα异源二聚体调节葡萄糖和脂质的体内平衡,而且它也是抗糖尿病药品GI262570 和噻唑烷2 期杨国伟等:不同日龄大白猪视黄素X 受体α基因的表达研究生物技术黑龙江农业科学 11二酮类的作用目标。Gampe 等[ 6] 报道了RXRα与配体9-cis-retinoic acid 配体结合区的晶体结构, 这个结构在分子水平上说明了RXRs 为什么能够与很多核受体形成异二聚体和可以通过9-cis-retinoic acid 激活PPARγ/RARα异源二聚体的原因。由于RXRs 不能单独行使其生物功能, 而必须与其他转录因子结合形成二聚体后, 才能发挥作用, 因此单独关于RXRs 基因的研究报道较少。本研究结果表明, RXRα基因在刚出生的仔猪组织内广泛表达, 并且表达水平较高。但是随着时间的增加, RXRαmRNA的表达变化并没有表现出明显的规律。尽管如此, 但仍可以看出,RXRαmRNA 的表达, 存在着明显的时间和空间差异。推测产生这种结果的原因, 一方面是因为该基因的表达受到机体自身生理状态的调节, 即随着机体的增长, 对视黄酸的需求也在不断变化, 所以RXRα的转录与表达也随之发生变化,另一方面也可能是因为体内的RARs 、激素以及其它转录因子也会对RXRα的转录产生影响, 因而造成了该基因的表达发生持续的变化。