《黑龙江农业科学》 2009年02
7-8,11
出版日期：2009-03-10
ISSN:1002-2767
CN:23-1204/S
饲料型四倍体刺槐组培苗的遗传学鉴定
四倍体刺槐(Tetraploid Robinia pseudoacacia)也称多倍体刺槐, 原产韩国。1997 年由北京林业大学引进。根据生物学特点可分为饲料型和速生型两种, 其中饲料型四倍体刺槐无刺、灌木状, 生长迅速, 叶宽且肥厚, 叶片含多种维生素与矿物质元素, 是很好的牲畜饲料, 为解决实施退耕还林、封山育林、天然林资源保护工程后出现的林牧矛盾, 特别是为上述地区畜牧业饲料发展找到了良好的途径[ 1] 。本研究利用RAPD 技术检测其组培苗的遗传变异程度, 为加强使用组培苗的安全性提供了可靠的理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料利用组培苗叶片作为提取DNA 的材料。随机选取10 株(1～ 5 号株采用NAA 培养, 6 ～ 10 号采用IBA培养)为分析材料, 以自然繁殖的苗木作为对照, 编号为11 号。试验中所选用的10 条RAPD 随机引物, 由上海生物工程公司合成。1 .2 DNA 提取方法及扩增条件DNA 的提取方法采用王关林和方宏筠[ 2] 的方法,稍加改动。在20 μL 反应体系中DNA 浓度为20 ng ,Mg2 + 浓度为0 .5 mmol · L-1 , 引物浓度为0 .25μmol·L-1 , 循环次数为35 次。热循环条件:94 ℃, 4min ;94℃, 1 min ;37 ℃, 2 min ;72 ℃, 4 min ;35 个循环后于72 ℃延伸10 min ;4℃, 1 h 。为了增强RAPD 稳定性和重复性, 并提高试验数据的可靠性,每次PCR 反应重复3 次,取可重复和清晰的条带进行记录, 每一个RAPD 扩增的条带记录为一个遗传位点, 扩增条带的有无分别记录为“1”和“0” 。用NTSYS-pc2.1 软件中的DICE 法计算植株之间的相似系数, 用UPGMA 法进行聚类分析, 绘制树状聚类图。2 遗传学鉴定利用10 条扩增效果较好的引物对四倍体刺槐组培苗基因组DNA 进行扩增, 扩增片段DNA 长度在 四倍体刺槐(Tetraploid Robinia pseudoacacia)也称多倍体刺槐, 原产韩国。1997 年由北京林业大学引进。根据生物学特点可分为饲料型和速生型两种, 其中饲料型四倍体刺槐无刺、灌木状, 生长迅速, 叶宽且肥厚, 叶片含多种维生素与矿物质元素, 是很好的牲畜饲料, 为解决实施退耕还林、封山育林、天然林资源保护工程后出现的林牧矛盾, 特别是为上述地区畜牧业饲料发展找到了良好的途径[ 1] 。本研究利用RAPD 技术检测其组培苗的遗传变异程度, 为加强使用组培苗的安全性提供了可靠的理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料利用组培苗叶片作为提取DNA 的材料。随机选取10 株(1～ 5 号株采用NAA 培养, 6 ～ 10 号采用IBA培养)为分析材料, 以自然繁殖的苗木作为对照, 编号为11 号。试验中所选用的10 条RAPD 随机引物, 由上海生物工程公司合成。1 .2 DNA 提取方法及扩增条件DNA 的提取方法采用王关林和方宏筠[ 2] 的方法,稍加改动。在20 μL 反应体系中DNA 浓度为20 ng ,Mg2 + 浓度为0 .5 mmol · L-1 , 引物浓度为0 .25μmol·L-1 , 循环次数为35 次。热循环条件:94 ℃, 4min ;94℃, 1 min ;37 ℃, 2 min ;72 ℃, 4 min ;35 个循环后于72 ℃延伸10 min ;4℃, 1 h 。为了增强RAPD 稳定性和重复性, 并提高试验数据的可靠性,每次PCR 反应重复3 次,取可重复和清晰的条带进行记录, 每一个RAPD 扩增的条带记录为一个遗传位点, 扩增条带的有无分别记录为“1”和“0” 。用NTSYS-pc2.1 软件中的DICE 法计算植株之间的相似系数, 用UPGMA 法进行聚类分析, 绘制树状聚类图。2 遗传学鉴定利用10 条扩增效果较好的引物对四倍体刺槐组培苗基因组DNA 进行扩增, 扩增片段DNA 长度在 四倍体刺槐(Tetraploid Robinia pseudoacacia)也称多倍体刺槐, 原产韩国。1997 年由北京林业大学引进。根据生物学特点可分为饲料型和速生型两种, 其中饲料型四倍体刺槐无刺、灌木状, 生长迅速, 叶宽且肥厚, 叶片含多种维生素与矿物质元素, 是很好的牲畜饲料, 为解决实施退耕还林、封山育林、天然林资源保护工程后出现的林牧矛盾, 特别是为上述地区畜牧业饲料发展找到了良好的途径[ 1] 。本研究利用RAPD 技术检测其组培苗的遗传变异程度, 为加强使用组培苗的安全性提供了可靠的理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料利用组培苗叶片作为提取DNA 的材料。随机选取10 株(1～ 5 号株采用NAA 培养, 6 ～ 10 号采用IBA培养)为分析材料, 以自然繁殖的苗木作为对照, 编号为11 号。试验中所选用的10 条RAPD 随机引物, 由上海生物工程公司合成。1 .2 DNA 提取方法及扩增条件DNA 的提取方法采用王关林和方宏筠[ 2] 的方法,稍加改动。在20 μL 反应体系中DNA 浓度为20 ng ,Mg2 + 浓度为0 .5 mmol · L-1 , 引物浓度为0 .25μmol·L-1 , 循环次数为35 次。热循环条件:94 ℃, 4min ;94℃, 1 min ;37 ℃, 2 min ;72 ℃, 4 min ;35 个循环后于72 ℃延伸10 min ;4℃, 1 h 。为了增强RAPD 稳定性和重复性, 并提高试验数据的可靠性,每次PCR 反应重复3 次,取可重复和清晰的条带进行记录, 每一个RAPD 扩增的条带记录为一个遗传位点, 扩增条带的有无分别记录为“1”和“0” 。用NTSYS-pc2.1 软件中的DICE 法计算植株之间的相似系数, 用UPGMA 法进行聚类分析, 绘制树状聚类图。2 遗传学鉴定利用10 条扩增效果较好的引物对四倍体刺槐组培苗基因组DNA 进行扩增, 扩增片段DNA 长度在 四倍体刺槐(Tetraploid Robinia pseudoacacia)也称多倍体刺槐, 原产韩国。1997 年由北京林业大学引进。根据生物学特点可分为饲料型和速生型两种, 其中饲料型四倍体刺槐无刺、灌木状, 生长迅速, 叶宽且肥厚, 叶片含多种维生素与矿物质元素, 是很好的牲畜饲料, 为解决实施退耕还林、封山育林、天然林资源保护工程后出现的林牧矛盾, 特别是为上述地区畜牧业饲料发展找到了良好的途径[ 1] 。本研究利用RAPD 技术检测其组培苗的遗传变异程度, 为加强使用组培苗的安全性提供了可靠的理论依据。1 材料与方法1.1 试验材料利用组培苗叶片作为提取DNA 的材料。随机选取10 株(1～ 5 号株采用NAA 培养, 6 ～ 10 号采用IBA培养)为分析材料, 以自然繁殖的苗木作为对照, 编号为11 号。试验中所选用的10 条RAPD 随机引物, 由上海生物工程公司合成。1 .2 DNA 提取方法及扩增条件DNA 的提取方法采用王关林和方宏筠[ 2] 的方法,稍加改动。在20 μL 反应体系中DNA 浓度为20 ng ,Mg2 + 浓度为0 .5 mmol · L-1 , 引物浓度为0 .25μmol·L-1 , 循环次数为35 次。热循环条件:94 ℃, 4min ;94℃, 1 min ;37 ℃, 2 min ;72 ℃, 4 min ;35 个循环后于72 ℃延伸10 min ;4℃, 1 h 。为了增强RAPD 稳定性和重复性, 并提高试验数据的可靠性,每次PCR 反应重复3 次,取可重复和清晰的条带进行记录, 每一个RAPD 扩增的条带记录为一个遗传位点, 扩增条带的有无分别记录为“1”和“0” 。用NTSYS-pc2.1 软件中的DICE 法计算植株之间的相似系数, 用UPGMA 法进行聚类分析, 绘制树状聚类图。2 遗传学鉴定利用10 条扩增效果较好的引物对四倍体刺槐组培苗基因组DNA 进行扩增, 扩增片段DNA 长度在200 ～ 2 000 bp(见图1), 共扩增出49 条清晰可辨的谱带, 各引物扩增出的谱带数为3 ～ 7 条, 平均每个引物扩增4.9 条;共扩增出多态性谱带数为12 条,平均每个引物为1.2 条。10 个引物中扩增谱带数最多的是S34,共扩增出7 条谱带,扩增谱带数最少的是引物S131, 仅扩增出3 条带, 多态性最高的引物为S130 , 多态性比例75 %,多态性最低的引物为S33 、S29、S100, 多态性比例为0 ,所有引物的平均多态性比例为26 .3%(见表1)。图1 引物S100 扩增产物的电泳图谱随机选取的10 株组培苗的相似系数变化范围从0.93～ 1 .00 ,平均相似系数为0 .96 ,其中1～ 5 号之间的相似系数为1 .00, 7 号植株和9 号植株、6 号植株和7号植株、6 号植株和10 号植株、9 号植株和10 号植株的遗传相似系数最小,为0 .93(见表2)。 利用UPGMA 方法进行聚类分析(见图2),在相似系数1 .00 处,利用激素NAA 培养所获得的1 ～ 5 号株与对照株11 号被聚为一类未发生遗传变异。利用激素IBA 培养所获得的6～ 10 号株未与对照株聚为一表1 10 个引物的扩增图谱结果引物扩增带数单态带数多态带数多态性比例/ %S34 7 6 1 14S33 4 4 0 0S8 5 5 2 40S32 6 5 1 16S29 6 6 0 0S130 4 1 3 75S131 3 2 1 33S132 5 5 3 60S100 5 5 0 0S75 4 3 1 25和(平均值) 49(4.9) 42(4.2) 12(1 .2) 263(26 .3)M 为marker DL200;1 ～ 5 为NAA 培养的组培苗, 6 ～ 10 为IBA 培养的组培苗;11 为对照图2 UPGMA 聚类图表2 遗传相似系数植株代号1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 1 .002 1 .00 1.003 1 .00 1.00 1.004 1 .00 1.00 1.00 1 .005 1 .00 1.00 1.00 1 .00 1 .006 0 .94 0.94 0.94 0 .94 0 .94 1.007 0 .96 0.96 0.96 0 .96 0 .96 0.93 1.008 0 .97 0.97 0.97 0 .97 0 .97 0.94 0.98 1 .009 0 .94 0.94 0.94 0 .94 0 .94 1.00 0.93 0 .94 1 .0010 0 .98 0.98 0.98 0 .98 0 .98 0.93 0.94 0 .96 0 .93 1 .0011 1 .00 1.00 1.00 1 .00 1 .00 0.94 0.96 0 .97 0 .94 0 .98 1 .00类, 其中6 号株和9 号株被聚为一类, 其余植株均发生了一定程度的遗传变异, 但与对照株的遗传相似系数均在90%以上, 变异幅度不大(见表2), 总之,从总体聚类结果来看, 经NAA 和IBA 培养的植株之间存在一定的遗传差异, 但是经NAA 培养的全部植株与对照株相比未发生变异, 保证了母株的遗传稳定性, 经IBA 诱导的全部植株与对照株相比均存在一定程度的变异。3 讨论饲料型四倍体刺槐作为一种生态型和经济型树种,具有极高的生态价值和经济价值, 市场需求量也越来越大,但自然状态下饲料型四倍体刺槐自我繁殖能力较低[ 3] , 难以满足市场需求。采用组织培养方法获得四倍体刺槐组培苗, 为其大规模的种植开发提供了可能。将饲料型四倍体刺槐组培技术应用于快繁, 关键在于保持其遗传稳定性。采用RAPD 分子标记技术对大量的组培苗进行遗传稳定性分析, 方法简单、快速, 可以直接从DNA 水平检测遗传性状的变化, 即从分子水平上阐明组培苗遗传稳定性的分子机理。目前, 用于检测组培苗遗传稳定性的分子标记技术已在水稻、春兰、果桑等植物上广泛应用[ 4-6] 。周克夫等利用SSR 标记技术, 根据康耐尔大学的资料设计了311对SSR 引物对早籼稻品种佳禾早占种植材料和组培材料进行分析, 对两种材料进行PCR 多态性扩增, 结果发现两者间存在多态性的引物有88 对, 多态性比例达到30.3 %。并证明, 佳禾早占水稻组培苗后代所表现出的矮秆性状与亲本在遗传物质上确有明显差别[ 4] 。除用来鉴定组培苗的遗传稳定性分子标记技术的方法以外, 还有细胞学方法、同工酶法、形态学鉴定法等均有报道[ 7-9] 。本研究应用RAPD 分子标记技术对四倍体刺槐组培苗基因组DNA 进行分析, 应用NAA 的组培苗之间出现了一定程度的变异, 这也进一步证明了经某些激素(浓度)处理的组培苗在DNA 水平上已经发生变异,其遗传物质不稳定,不能有效保证母株的遗传特性, 这与前人关于芥蓝[ 10] 、苹果[ 11] 等组培苗遗传稳定性的研究报道不一致。由此可见, 以组培快繁技术快速扩大饲料型四倍体刺槐的生产量, 还应该从分子水平进行进一步的鉴定, 从而有效保证组培苗的纯度。