《黑龙江农业科学》 2009年02
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出版日期：2009-03-10
ISSN:1002-2767
CN:23-1204/S
亚麻RAPD 的反应体系优化及引物筛选
亚麻是优良的纺织和油料作物, 是我国重要的经济作物之一。作物种质资源的收集和鉴定是作物育种的基础性工作, 目前亚麻育种以品种间杂交为主, 亚麻资源传统的评价方法多偏重于形态、生化等方面, 受环境或人为因素影响大,因此, 对亚麻种质资源的正确评价是育种的关键,分子技术能直接从DNA 水平上反映各材料间的遗传差异, 进而消除环境或人为因素造成的误差。RAPD 是Williams 和Welsh 领导的两个研究小组几乎同时独立发展起来的一种DNA 技术[ 1-2] 。RAPD 技术能直接从DNA 水平上反映各材料间的遗传差异, 是研究遗传多样性的有力工具。RAPD 技术具有简单、快速、安全的特点, 被广泛用于遗传图谱的构建、品种鉴定和遗传多样性的研究。遗传丰富的种质资源是实现培育亚麻新品种育种目标的前提和基础。我国现已收集保存国内外亚麻资源4 000 多份, 通过本实验筛选出的引物并利用本研究优化的适宜亚麻RAPD 的PCR 条件, 能快速准确地鉴定这些资源的亲缘关系, 可以为建立亚麻核心种质库提供准确的分子依据, 还可以为我们从国外引进亚麻种质资源的入库和分类提供技术平台。1 材料与方法1 .1 材料1 .1 .1 植物材料Diane(法国)、FANY(荷兰)、黑亚12(中国)均由黑龙江省农业科学院经济作物所提供。1 .1 .2 酶与试剂 rTaq DNA 聚合酶、dNTP 、100 bpladder 、琼脂糖等购于天根生化科技(北京)有限公司;DL2000 购于宝生物工程(大连)有限公司;常规试剂均购于天根生化科技(北京)有限公司。1 .1 .3 PCR 引物 70 条RAPD 引物购于上海生工。引物标号分别为:S1 ～ S50 , S61 ～ S64,A1 ～ A16, S 字母开头的网上可以查到序列,A1～ A16 的序列见表1。1 .2 方法1 .2 .1 亚麻总DNA 提取与检测亚麻总DNA 提取参照王关林、方宏筠的方法[ 3] 。分别取0 .2 g 4 个品种的叶片提取总DNA , 提取的DNA 分装贮于-20 ℃;亚麻总DNA 的浓度检测采用琼脂糖凝胶电泳法, 琼脂糖凝胶电泳方法参照萨姆布鲁克的方法[ 4] , 取1 μL 所提取的各Genome DNA 在0 .8%Agarose 上进行电泳, 和标准分子量λDNA/HindⅢ比较, 进而检测所提取各GenomeDNA 的浓度和完整性。表1 引物A1 ～ A16 的序列标号序列标号序列标号序列A1 GGGCACGCGA A7 TAGACAGAGG A13 CCGCCCAC TGA2 GAGTAAGCGG A8 GAATGCGAGG A14 CCCACACCACA3 CCGCGAGCAC A9 GGAAGGCTGT A15 GGTTTGGTGGA4 CGGTGGCGAA A10 GGTCAGGGCT A16 GGGTGTGGTTA5 GCCACGGAGA A11 GTACATGGGCA6 TCCCGAACCG A12 CCGGTTCCAG1.2 .2 RAPD 反应条件 为确定最佳的PCR 反应体系, 设置4 个Taq 酶浓度:0.5、1 、1 .5 、2 U ;4 个dNTP浓度:0 .2 、0 .25、0 .3 、0 .35 mmol ·L-1 。选用A5 引物,其浓度设4 个:0.5、1 、1 .5 、2 μmol·L-1 ;退火温度设3个:35、36、37℃。根据扩增结果, 选择出最佳的PCR 反应体系。PCR 扩增程序为:94 ℃预变性4 min ;94 ℃变性40 s , 35 、36 、37 ℃退火1 min, 72 ℃延伸90 s, 40 个循环;72℃再延伸10 min 。2 结果与分析2.1 PCR 反应优化2.1 .1 不同Taq 酶浓度对扩增结果的影响试验Taq 酶浓度选用0 .5 、1、1 .5 、2 U 共4 个梯度, 从图1 中可以看出0 .5 U 时仅扩增出一条带, 当增加到1 U 时扩增效果较好, 因此确定1 U 是最佳浓度。图1 Taq 酶浓度对PCR 反应的影响2.1 .2 不同dNTP 浓度对扩增结果的影响本试验dNTP 浓度设了4 个梯度分别为0.2、0.25 、0 .3 、0 .35mmol·L-1 ,图2 中dNTP 浓度为0.2 mmol·L-1时扩增条带少, 当0.25 mmol·L-1 时扩增的条带数目多而且清晰, 当dNTP 浓度为0.3 mmol·L-1和0.35 mmol·L-1时条带数量又减少,因此0.25 mmol·L-1是最佳浓度。图2 dNT P 浓度对PCR 反应的影响2 .1 .3 不同引物浓度对扩增结果的影响本试验引物浓度设4 个梯度:0 .5 、1 、1 .5 、2 μmol·L-1 , 图3中显示0 .5 和1 μmol ·L-1 扩增的条带不清晰, 1 .5和2 μmo l·L-1 扩增的效果好, 但二者没有明显区别, 因此确定1 .5 μmol·L -1是最佳浓度。图3 引物浓度对PC R 反应的影响2 .1 .4 不同退火温度对扩增结果的影响从所设的35 、36 、37 ℃退火温度的三个梯度可看出(见图4), 37 ℃是最佳温度。图4 退火温度对PC R 反应的影响2 .2 优化后亚麻最佳RAPD 反应条件及PCR程序通过Mg2 +浓度优化、dNTP 浓度优化、引物浓度优化、基因组DNA 浓度优化、Taq 酶浓度优化,最终确定如下优化后的PCR 体系。优化出适宜亚麻RA PD 的PCR 反应体系PCR 体系(25 μL):10×Buffer ,Mg2 +(1 mmol · L-1), dN TP(0 .25 mmo l·L-1), primer(1 .5 μmo l· L-1), Genome DNA (50ng), Taq1 U 。优化出适宜亚麻RAPD 的PCR 程序通过退火温度梯度试验, 确定优化后的PCR 程序:94 ℃预变性4 min ;94 ℃变性40 s , 37 ℃退火1 min ,72 ℃延伸90 s , 40 个循环;72 ℃延伸10 min 。2 .3 筛选出适宜亚麻RAPD 的引物筛选出适宜亚麻RAPD 的引物12 条, 其序列见表2 。表2 筛选出的引物序列标号序列标号序列标号序列S7 GGTGACGCAG S 28 GTGACGTAGG A5 GCC ACGGAGAS10 CTGC TGGGAC S 43 GTCGCCGTC A A10GG TCAGGGCTS21 CAGGCCC TTC S 48 GTGTGCCCC A A13 CCGCCCACTGS24 AATCGGGC TG S 61 TT CGAGCCAG A15GGT TTGGTGG 从70 条引物中选取扩增结果较好的引物如图5 、图6 和图7 , 综合Diane 、FAN Y 、黑亚12 三个品种为模板的结果, 70 条引物中有12 条引物(序列见表2)扩增出的条带清晰, 多态性好, 重复性好。3 讨论利用RAPD 标记进行种质资源多样性分析的效果因不同作物、试验材料和所选引物而异。种质资源的遗传多样性研究不仅可以为新品种选育策6 黑龙江农业科学图5 Diane 为模板进行PCR 所筛选引物图6 FANY 为模板进行PCR 所筛选引物图7 黑亚12 为模板进行PC R 所筛选引物略的制定提供依据, 还可以为亲本选配、后代遗传变异程度及杂种优势水平的预测提供预见性指导。通过本研究优化的适宜亚麻RAPD 的PCR 体系和程序, 并利用本研究筛选出的适宜亚麻RAPD的引物可以对亚麻种质资源进行分子鉴定, 可以弥补传统方法的缺陷, 能更快速更准确地鉴定亚麻种质资源的亲缘关系, 更好地为亚麻育种和资源的保存提供依据