《黑龙江农业科学》 2009年02
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出版日期：2009-03-10
ISSN:1002-2767
CN:23-1204/S
大豆干旱和低温cDNA 文库的构建与检测
全球干旱半干旱地区约占陆地面积的35 %, 遍及世界60 多个国家和地区, 在我国约占国土面积的52.5%, 其危害相当于其它自然灾害之总和[ 1] , 而低温冷害在农业生产中则严重制约作物的种植时间和区域。由于这两个因素都属于多基因控制的数量性状,通过传统育种手段进行遗传改良的难度很大, 生物技术手段为分离干旱、低温相关基因, 进而通过转基因方法改善植物的抗逆性提供了一个切实可行的途径。基因分离的手段很多, 建立cDNA 文库则是一个有效的手段。自20 世纪70 年代中期首例cDNA 克隆问世以来, 构建cDNA 文库已成为克隆基因、研究功能基因组学的基本手段之一。由于cDNA 文库是某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合,没有内含子,可以直接获得目的基因, 因而受到广泛重视。中国是大豆的起源地, 已有4 000 多年的栽培历史, 研究和利用大豆基因资源具有特殊的意义。本研究以栽培大豆为材料, 通过干旱和低温处理, 构建cDNA融合表达文库, 为今后分离抗逆相关基因和分子育种工作奠定了基础。1 材料与方法1 .1 材料栽培大豆(Glycinemax)品种为吉林35 , 来自吉林省农业科学院大豆研究所;大肠杆菌菌株DH5α和酵母菌株YM4271 ;用于构建文库的试剂盒(购自Stratagene公司);提取总RNA 的Trizol 试剂盒(购自Invitrogen公司);限制性内切酶、T4 连接酶、DNA 片断回收试剂盒(均购自大连宝(TaKaRa )生物工程公司), 氨苄青霉素为国产针剂, 其他试剂均为国产分析纯。1 .2 方法1 .2 .1 材料处理 大豆种子用水浸泡24 h , 置于滤纸上25 ℃发芽,然后植于装有珍珠岩的纸杯中, 保持水分和光照, 待长到15 cm 左右时,取出并保持根系不受损伤, 清水洗净,进行如下处理:(1)干旱处理:将上述植株置于恒温箱中, 25 ℃下处理4 h ;(2)低温处理:将上述植株置于4℃冰箱中, 处理4 h ;处理完毕之后, 整个植株用锡纸包好, 液氮速冻, 然后置于超低温冰箱中备用。1.2 .2 总RNA 的提取和质量检测提取总RNA 的Trizol 试剂盒购自Invit rogen 公司, 方法按照试剂盒的说明书进行。沉淀后用DEPC 水溶解, 变性凝胶电泳检测RNA 的完整性。同时用紫外分光光度计测定260nm 和280 nm 的吸光值,检查RNA 的纯度。1.2 .3 cDNA 双链的合成及其融合表达文库的构建采用磁珠法从总RNA 中分离出mRNA ,cDNA 的合成与融合表达文库的构建采用HybriZAP-2 .1 XR libraryconstruction kit 和HybriZAP-2 .1 XR cDNA synthesiskit , Stratagene 试剂盒。具体方法参见试剂盒的用户操作指南(Catalog #235612)。本研究选用的融合表达载体为pAD-GAL4 phagemidVector(Hybrid ZAP TM, Stratagene 公司), 载体的图谱如图1 所示。图1 pAD-GAL4 质粒载体1.2 .4 原始文库和扩增文库滴度的测定 培养XL1-Blue 宿主菌,用包装产物噬菌体颗粒在顶层琼脂中转染宿主菌, 混匀后铺平板, 37℃条件下6 ～ 8 h 可以看到嗜菌斑, 按吴晓林等[ 2] 方法测定文库的滴度P(pfu·mL-1)=噬菌斑数×稀释倍数×103/噬菌体铺板体积。由于原始文库的稳定性较差, 因而可以将原始文库继续感染宿主菌, 扩增一次, 得到更加稳定的扩增文库。在扩增文库中加7 %的二甲基亚砜(DMSO)后分装并置于-70 ℃超低温冰箱中保存备用。1.2.5 cDNA 文库的质量鉴定从干旱和低温两个原始文库随机各挑取50 个噬菌斑, 根据载体插入位点两端的序列合成引物:Primer1 :5’-AGGGATGTTTAATACCACTAC-3’Primer2 :5’-GCACAGTTGAAGTGAACTTGC-3’PCR 扩增,反应条件如下:93℃ 5 min ;48℃ 5 min ;1 个循环72℃ 2 min ;93℃ 1 min ;48℃ 1 min ;30 个循环72℃ 延伸10 minPCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳。2 结果与分析2 .1 总RNA 与mRNA 的质量检测提取的总RNA , 用变性凝胶电泳检测(见图2), 可以看见28 s 和18 s 条带, 而且28 s 的亮度约为18 s 的2 倍, 证明RNA 完整性较好, 没有降解。紫外分光光度计检测总RNA 的吸光值, 发现在260 nm 和280 nm处的吸光值之比分别为1 .98 和2 .10, 说明纯度较好,没有污染。采用磁珠法从总RNA 中分离mRNA , 逆转录合成cDNA 第一链过程中加入32 P 同位素标记,X 光片显示合成的cDNA 长度在0.5 kb 以上,呈弥散状态,说明mRNA 质量较好, 可用于构建cDNA 文库。图2 总RNA 在甲醛变性凝胶上电泳分析图3 cDNA 第一链合成检测2 .2 文库滴度用包装产物感染XL1-Blue 菌, 并将感染后的菌液进行稀释后, 进行文库滴度测定。计算出两个原始文库的滴度分别为:A 库(干旱):2.75 ×106 pfu·mL-1 ;B库(低温):5.52×105pfu·mL-1 。由此可见,这两个文库的滴度可以满足分离低丰度cDNA 的要求。为了得到稳定的文库, 重新用噬菌体感染XL1-Blue 寄主菌, 当菌斑直径小于1 ～ 2 mm时, 用SM buffer 收集平板上的菌体,稀释后再次涂板,测定扩增文库的滴度, 结果干旱(A 库)和低温(B 库)文库的滴度分别为:A 库(干旱):2.24 ×109 pfu·mL-1 ;B库(低温):1.7 ×108pfu·mL-1 。一般来说, 扩增文库的滴度在108 ～ 1011pfu·mL-1 ,可见这两个文库的滴度符合要求。2 .3 文库插入片断长度分析从干旱和低温两个原始文库中各随机挑取50 个噬菌斑, 用上述引物进行PCR 检测, 检查文库中插入的cDNA 片段长度, 图4 仅为PCR 扩增的部分结果。可以看出,插入cDNA 片段的长度在0 .5 ～ 2.0 kb , 说明插入片段的长度较大, 而且从整个扩增的结果看, 每个反应均可以得到PCR 产物, 说明插入重组的效率非常高。A :干旱处理文库;B:低温处理文库图4 cDNA 文库插入片段长度的PCR 分析从上述结果可知, 构建的两个cDAN 文库的质量是比较高的, 完全可以满足后续分离目的基因的要求。3 讨论3.1 关于cDNA 文库的质量cDNA 文库的质量有两个主要指标, 一是文库的代表性, 可用库容量来衡量, 即整个文库的容量是否能将所有的信息包括进来, 具体表现在滴度的大小上, 滴度越大表明获得目的基因的可能性越大。一般来说,文库滴度能达到105pfu·mL-1以上即为有效文库[ 3] ;二是插入cDNA 片段序列完整性, 即插入片段的长度越长, 表明分离到基因全长的可能性越大。本研究对大豆材料进行了干旱和低温处理, 可以大幅度提高目的基因的表达量, 理论上即使是低丰度的基因也可以筛选出来。此外, 从PCR 扩增的结果看, cDNA 片段插入重组的比率非常高, 也为今后基因分离的效率提供了有力保证。3.2 应用cDNA 文库分离新基因已有的研究表明, 植物在受到干旱和低温胁迫的情况下, 相关基因的表达受一种转录因子的调控, 这种转录因子包括一个核心的顺式作用元件DRE(dehydraionresponsive element)序列, 它是一个9 bp 的核酸序列(TACCGACAT ), 其中5 bp 的核心序列(CCGAC)称为CRT(c-repeat),它一般位于低温、干旱、高盐等逆境相关基因的启动子当中[ 4] 。因此, 分离这类转录调控因子对研究逆境分子机理就非常重要, 本文库采用的载体就是基于这个目的而构建的。我们已经得到了含有4 个DRE 重复序列的报告子, 共转化感受态的酵母菌, 就可以利用酵母单杂交技术筛选文库当中含有DRE 元件的转录调控因子。目前, 该技术已经被广泛用于多个植物中[ 5-8] 。我们利用此技术对两个文库进行了初步筛选, 得到了4 个阳性克隆, 初步的测序分析表明,分别与UDP-葡萄糖脱氢酶、茁长素抑制蛋白和花芽分化有关, 此结果为下一步分离全长基因和功能验证奠定了基础